由于高度增殖和分化能力，干细胞在人类医学中具有巨大的应用潜力。所以正如当前临床前和临床研究表明，它毋庸置疑地被广泛用于一系列医疗应用中，如针对骨骼和软骨再生、治疗心肌、糖尿病治疗、脊髓损伤修复等，甚至有助于减缓整体衰老过程。但是，要保持所需的数量的细胞质量一致，目前急需一种可以替代目前的2D平面模式培养方案，利用搅拌式生物反应器进行脂肪组织和骨髓来源的 hMSC生长在固体或多孔微载体上已被证明适用于台式和中试规模 。

这对于一次性生物反应器来说情况尤其如此 ，其主要优点是能够提供较高的工艺安全性和灵活性。因此，如何设计一款合适的生物反应器保证与2D培养模式获得相同甚至更优异的扩增倍数及分化效果成为目前主流的课题，本篇文章主要从产品设计及工艺角度评估与优化干细胞微载体形式培养工艺，旨在提高干细胞培养效果。

【搅拌桨桨叶设计对干细胞培养的影响评估】

搅拌桨桨叶设计对于干细胞微载体形式培养具有显著影响，尤其是对于微载体悬浮及细胞培养剪切力的影响。Elephant Ear型搅拌桨因为采用斜桨设计，同时在转动时带来流体在水平及轴向两个方向的流动，因此具有混合效果好及剪切力小的优点，通常适用于包括哺乳动物细胞及干细胞的细胞培养（如图1）。

图1：Elephant Ear 桨叶示意图

Elephant Ear型搅拌桨目前有多种角度形式的设计，经过水平方向30度、45度及60度角度设计对比发现，30度搅拌桨虽具有较低的剪切速率，但其轴径向流运动分布较差，不利于营养物质的快速传质及微载体等颗粒物的悬浮；而60度搅拌桨设计则与之相反，轴径向流运动分布较佳，但剪切速率非常高，对于细胞培养容易造成损伤风险；相比之下，45度桨叶相较于其他两种类型具有较低的剪切率范围及相对较均匀的速度分布（如图2），有利于营养物质的传递及较低的微载体及细胞损伤风险，使之非常适合于微载体悬浮。

图2：桨叶角度与位置设计轴向流速度分布展示图

此外，桨叶的安装位置同样会影响流体循环及动力消耗，如果桨叶安装过低，会使流体还没有达到液面就发生转向，减低循环效率，同时会造成细胞及微载体撞击罐体底面损伤细胞形成“研磨效应”；如果桨叶安装过高，则底部产生的循环流动很小，造成锥形死区面积较大，循环效果变差，因此为了良好的循环流动状态及微载体悬浮效果，需要对搅拌桨位置进行优化，以进一步减少罐底锥形导流区并有效降低微载体悬浮的搅拌速率（图3），从而降低剪切速率，有效提高细胞培养密度及活率。实验表明，桨叶经过30度调整至45度及位置优化设计进行的MSC间充质干细胞的微载体悬浮培养工艺可较相同条件下的反应器培养密度提高到2.4倍以上。

搅拌桨组数、组合及分布对细胞培养同样存在影响。通常较大规模细胞培养采用双层桨结构设计，该类型结构中搅拌桨相对位置及搅拌桨组合形式均会影响细胞培养过程中的气含率、功率消耗和气液传质性能。

Elephant Ear搅拌桨为轴流桨，对底桨的剪切应力分布影响较小，双层Elephant ear桨叶合理位置分布能改善流速不均并抑制局部涡流的形成，实现桨叶间较强的流场联动。采用不同组合方式时，由于桨与桨之间可存在局部涡流，导致流体速度分布不均，造成桨叶间流场的接连作用减弱，或顶桨排出流体对底层桨叶产生较大的冲击作用，导致底层桨的平均剪切应力有所减小，因此需要选择合理的桨叶搭配与桨间距离来改善较优的流速分布。此外，由于大部分气相滞留和气液传质发生在底层桨附近，可采用较大功率准数的底层桨来实现较好的气泡剪切作用及分散滞留效果，从而增加氧传质效果；顶桨周围的气含率相对较小，因此可以选择具有较小功率准数的轴流桨来降低功耗，并同时强化大循环流结构对气泡的滞留作用与气液传质能力。

图3：标准桨叶与优化后微载体最低悬浮转速Njs（浅蓝）与最低底部移动所需速度Ns1u（深蓝）对比

【适合于干细胞培养的搅拌速率的确定】

反应器搅拌速率对于干细胞培养具有重要的影响和作用，常见的间充质干细胞MSC因需贴附于微载体上进行培养，故需要通过优化搅拌桨转速实现微载体悬浮及混匀效果，并有效降低剪切力影响。微载体悬浮培养常用的临界转速Njs可用于评估微载体等颗粒离底悬浮所需的最低转速。Njs转速可确保微载体在罐体底部存留时间不超过2秒钟。在缺乏S常数的情况下，Njs值通常可采用某一微载体浓度下经验测定S值并应用于预测其他微载体浓度下的搅拌速度。

微载体Njs悬浮速度与溶液粘度、微载体-溶液密度差、投放微载体浓度及微载体直径成正比关系，与搅拌桨直径成反比关系，因此从设计角度出发，采用较大桨叶的设计有助于实现较低的搅拌速度及可实现微载体的悬浮，从而减少剪切力对微载体及细胞的影响。

S: 兹维特林 Njs 常数 , 

υ: 运动粘度(m2/s), 

g: 重力常数(m/s2),

s: 固态物质密度(kg/m3), l

l: 溶液密度(kg/m3), 

X: 装载固体浓度((kg 固体/kg 液体) × 100), 

dp: 颗粒物直径(m), 

D: 搅拌桨叶直径(m).

在干细胞的微载体悬浮培养过程中，细胞及微载体同样容易受到培养条件中较高搅拌速度下形成的涡流的影响，造成细胞脱落或损伤以及微载体的损坏，因此对于干细胞的微载体悬浮培养工艺，搅拌速度上限需要明确限定以保证培养的成功率。涡流的影响由Kolmogorov涡流尺寸作为评判标准评估，通常Kolmogorov涡流尺寸低于细胞及微载体直径的2/3会对细胞及微载体造成损伤，因此，需要保证Kolmogorov涡流尺寸大于该标准，此时相应的搅拌速度可以定义为Nk。例如，微载体直径为200um左右，Kolmogorov涡流尺寸要求不高于133um，以降低潜在的细胞损伤影响。

图4：微载体悬浮培养工艺搅拌转速可操作区间示意

搅拌桨组数、组合及分布对细胞培养同样存在影响。通常较大规模细胞培养采用双层桨结构设计，该类型结构中搅拌桨相对位置及搅拌桨组合形式均会影响细胞培养过程中的气含率、功率消耗和气液传质性能。

λk: Kolmogorov 涡流尺寸 (m), 

υ: 溶液运动粘度 (m2/s), 

εT: 动能耗散率 (W/kg), 

Np: 搅拌桨功率准数, 

N: 搅拌桨转速 (rps), 

D: 搅拌桨直径 (m), 

V: 溶液工作体积 (m3).

基于以上分析，反应器中某一浓度下微载体含量的搅拌速度上下限即可通过Njs与Nk来限定，即Njs<n<n< span="">k（如图4）。需要指出的是，在培养过程中，细胞在微载体表面的增殖会影响微载体直径的变化，因此在实际培养过程中需要充分评估，可适当增大搅拌速度以抵消该影响。

生物反应器培养已成为干细胞产业化培养的关键工具，对于生物反应器的设计，可综合搅拌桨叶类型、角度及直径大小以及桨叶组合的方式并进行充分优化，最终达到温和的干细胞培养环境，并最终实现较高的扩增倍数、活率及分化效果。

【参考文献】

Process development for expansion of human mesenchymal stromal cells in a 50 L single-use stirred tank bioreactor .Tristan Lawson∗, Daniel E. Kehoe1, Aletta C. Schnitzler, Peter J. Rapiejko, Kara A. Der, Kathryn Philbrick2, Sandhya Punreddy, Susan Rigby, Robert Smith, Qiang Feng3, Julie R. Murrell, Martha S. Rook,Biochemical Engineering Journal120(2017)49-62

[2] Modification and qualification of a stirred single-use bioreactor for the improved expansion of human mesenchymal stem cells at benchtop scale.Valentin Jossen*,1, Stephan C Kaiser1, Carmen Schirmaier1, Jacqueline Herrmann2, Alexander Tappe2, Dieter Eibl1, Ann Siehoff3, Christian van den Bos3 & Regine Eibl1.Pharm. Bioprocess. (2014) 2(4), 311–322

[3] XIE Nannan, CHEN He, YE Guanghua, SHU Zhongming, FU Songbao, ZHOU Xinggui. Interaction of multiple impellers for gas-liquid stirred tank and optimization of their combinations[J]. CIESC Journal, 2025, 76(2): 564-575

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